Афинная хроматография
7

ди- и полиамины, ω-аминокислоты, пептиды, олигосахариды. Лигандами могут служить такие субстраты как крахмал или гликоген, однако их превращение в ходе аффинной хроматографии, катализируемое разделяемым ферментом, постоянно изменяет свойства сорбента. Поэтому, как правило, применяют аналоги субстратов, устойчивые к дальнейшему превращению, т.е. ингибиторы ферментов. Так, для выделения протеиназ используют не расщепляемые ими пептиды D-аминокислот. Эффективны также природные ингибиторы ферментов, например, пепстатин-ингибитор аспартильных протеиназ. Иногда применяют лиганды, связывающие большие группы родственных ферментов (в частности, киназы и дегидрогеназы). Примеры таких "группоспецифических" лигандов – антрахиноновые красители, аналоги никотинамидаденин-динуклеотида. Известны лиганды (например, производные фенилборной кислоты), имитирующие при взаимодействии с ферментом структуру переходного комплекса с субстратом. Такие лиганды эффективны при выделении сериновых гидролаз.

 

1.1.2 Подвижная фаза

 

Подвижная фаза аффинной хроматографии должна элюировать анализируемые соединения с оптимальными значениями k', обладать низкой вязкостью, обеспечивать необходимый уровень селективности, быть дешевой, нетоксичной, инертной, совместимой с методами детектирования (например, с УФ-детектором нельзя использовать в качестве элюента бензол). Обычно используют углеводороды (гексан, гептан, изооктан, циклогексан) с добавлением небольших количеств СНСl3, изо-С3Н7ОН, диизопропилового эфира. Если компоненты разделяемой смеси имеют близкие значения k', хроматографируют одним элюентом (изократический режим), если отдельные компоненты смеси сильно удерживаются сорбентом, используют серию элюентов возрастающей силы (ступенчатое или непрерывное градиентное элюирование).

Аффинная хроматография представляет собой один из наиболее специфических методов выделения реакционноспособных соединений, в частности, ферментов, и даже таких надмолекулярных агрегатов, как вирусы. Разделение биологически активных веществ в этом варианте хроматографии основано на их специфическом взаимодействии с